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超分辨率成像荧光探针材料应用进展

刘志贺 吴长锋

刘志贺, 吴长锋. 超分辨率成像荧光探针材料应用进展[J]. 中国光学, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
引用本文: 刘志贺, 吴长锋. 超分辨率成像荧光探针材料应用进展[J]. 中国光学, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
LIU Zhi-he, WU Chang-feng. Advances in application of materials of super-resolution imaging fluorescent probe[J]. Chinese Optics, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
Citation: LIU Zhi-he, WU Chang-feng. Advances in application of materials of super-resolution imaging fluorescent probe[J]. Chinese Optics, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

doi: 10.3788/CO.20181103.0344
基金项目: 

国家自然科学基金 Grant No.61335001

国家自然科学基金 Grant No.81771930

深圳市科技创新委员会基金 Grant No.JCYJ20170307110157501

详细信息
    作者简介:

    刘志贺(1992—),男,辽宁朝阳人,博士研究生,2016年获得吉林大学硕士学位,主要从事超分辨荧光成像及荧光探针方面的研究。E-mail:liuzhihe002@163.com

    吴长锋(1976—),男,山东德州人,博士,教授,博士生导师。主要从事半导体聚合物点(Polymer Dot)作为新型生物荧光探针的研究,拓展聚合物点在超分辨细胞成像、活体成像、生物传感器、光动力学治疗等领域的应用。E-mail:wucf@sustc.edu.cn

  • 中图分类号: R318.51

Advances in application of materials of super-resolution imaging fluorescent probe

Funds: 

the National Natural Science Foundation of China Grant No.61335001

the National Natural Science Foundation of China Grant No.81771930

Shenzhen Science and Technology Innovation Commission Grant No.JCYJ20170307110157501

More Information
  • 摘要: 为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。
  • 图  1  不同生物成像技术空间分辨率对比图

    Figure  1.  Spatial resolution comparison of different biological imaging techniques

    图  2  STED超分辨显微镜原理示意图[25]

    Figure  2.  Basic light-pathway diagram and the principle of STED microscopy[25]

    图  3  红光发射的罗丹明荧光分子结构式

    Figure  3.  Chemical structures of red-emitting rhodamine fluorophores

    图  4  用于STED荧光显微镜的荧光分子1及其衍生物结构式

    Figure  4.  Chemical structures of fluorescent molecular 1 and derivatives used in STED microscopy

    图  5  荧光分子2和3的化学结构式及在活细胞中的正交反应示意图

    Figure  5.  Chemical structures of fluorescent moleculars 2 and 3 and the bioorthogonal reaction in live cells

    图  6  荧光分子4~7的化学结构式

    Figure  6.  Chemical structures of fluorescent moleculars 4~7

    图  7  光激活定位显微镜和随机光学重构显微镜工作原理及亚细胞结构超分辨图(左侧:PALM及COS-7细胞溶酶体超分辨图像;右侧:STORM原理图及亚细胞结构单色、多色超分辨图像)[14, 17]

    Figure  7.  Working principle of Photoactivation Localization Microscopy, Stochastic Optical Reconstruction Microscopy and subcellular structure super resolution images(Left: PALM and COS-7 cell lysosomal superresolution images; right:STORM schematic and subcellular structure monochrome, multicolor super-resolution images)[14, 17]

    图  8  荧光分子8~10的化学结构式

    Figure  8.  Chemical structures of fluorescent moleculars 8~10

    图  9  罗丹明衍生物(11~21)光诱导转换过程分子结构式

    Figure  9.  Photoinduced reversible switching process of rhodamine derivatives(11~21)

    图  10  Carbofluoresceins,Carborhodamines110的分子结构式

    Figure  10.  Chemical structures of carbofluoresceins, carborhodamines110(28)

    图  11  分子25~32开关过程的化学结构式以及通过荧光分子31实现的细胞超分辨率图像;紫外光照射下分子34的光开关转换过程[52-53]

    Figure  11.  Chemical structures and the switching process of 25~32 and superresolution images obtained with 31 in live cells. Photoswitchable process of 34 under irradiation with UV/visible light[52-53]

    图  12  (a~c)3种不同DNA结构的三色STORM图像(Alexa405/Cy5, Cy2/Cy5和Cy3/Cy5标记;405 nm, 457 nm和532 nm激光激发);(d)Alexa647/Cy3标记的BC-S-1细胞内网格蛋白凹坑(CCPs)的三维STORM图像[54-55]

    Figure  12.  (a~c)Three-color STORM images of three different DNA constructs(labelled with Alexa405/Cy5, Cy2/Cy5, and Cy3/Cy5, activated using 405, 457 and 532 nm laser, respectively); (d)3D STORM image of clathrin-coated pits(CCPs) stained with the Alexa647/Cy3 in BS-C-1 cells[54-55]

    图  13  花青染料(35~40)分子式和假设的闪烁机制

    Figure  13.  Chemical structures of cyanine dyes(35~40) and the proposed photoblinking mechanism

    图  14  STORM荧光探针41~48结构式及细胞微管的超分辨图像[62];Si-罗丹明荧光分子(49~55)衍生物以及分子54在合适pH环境中闪烁机制的模型及相应的化学结构式[65]; ATTO655标记的CCR5在水和重水不同环境下,分子56和57在光照时互相转化过程以及亚细胞结构图像[66]

    Figure  14.  Chemical structures of fluorescent dyes(41-48) used in STORM[62]; Chemical structures of 49-55 and proposed photoblinking mechanism of 54 in a suitable pH environment[65]; Photoswitching between 56 and 57 upon photoirradiation in the presence of oxygen and ATTO655-labelled CCR5 imaging of live cells in H2O and D2O[66]

    图  15  SOFI成像原理示意图及使用Qdots标记的细胞微管SOFI图像[19, 67, 72]

    Figure  15.  Principle of SOFI imaging and SOFI images of cell microtubule labeled with Qdots[19, 67, 72]

    图  16  聚合物荧光探针分子58~59化学结构式,荧光闪烁特性和单色细胞微管标记图像[83]

    Figure  16.  Chemical structure and photoblinking property of fluorescent polymer probe molecules(58~59), single-color microtubule images labelled with polymer dots[83]

    图  17  聚合物荧光探针分子61~62化学结构式,荧光闪烁特性和细胞微管多色标记图像[84]

    Figure  17.  Chemical structure and photoblinking property of fluorescent polymer probe molecules(61~62), multi-color microtubule images labelled with polymer dots[84]

    图  18  SIM/SSIM原理图, 宽场显微镜和SIM显微镜下GFP标记的COS-7细胞线粒体结构图

    Figure  18.  Principlephotos of SIM and SSIM. GFP-stained mitochondria in COS-7 cells imaged with conventional wide-field and structured illumination microscopy

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出版历程
  • 收稿日期:  2018-01-23
  • 修回日期:  2018-03-13
  • 刊出日期:  2018-06-01

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

doi: 10.3788/CO.20181103.0344
    基金项目:

    国家自然科学基金 Grant No.61335001

    国家自然科学基金 Grant No.81771930

    深圳市科技创新委员会基金 Grant No.JCYJ20170307110157501

    作者简介:

    刘志贺(1992—),男,辽宁朝阳人,博士研究生,2016年获得吉林大学硕士学位,主要从事超分辨荧光成像及荧光探针方面的研究。E-mail:liuzhihe002@163.com

    吴长锋(1976—),男,山东德州人,博士,教授,博士生导师。主要从事半导体聚合物点(Polymer Dot)作为新型生物荧光探针的研究,拓展聚合物点在超分辨细胞成像、活体成像、生物传感器、光动力学治疗等领域的应用。E-mail:wucf@sustc.edu.cn

  • 中图分类号: R318.51

摘要: 为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。

English Abstract

刘志贺, 吴长锋. 超分辨率成像荧光探针材料应用进展[J]. 中国光学, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
引用本文: 刘志贺, 吴长锋. 超分辨率成像荧光探针材料应用进展[J]. 中国光学, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
LIU Zhi-he, WU Chang-feng. Advances in application of materials of super-resolution imaging fluorescent probe[J]. Chinese Optics, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
Citation: LIU Zhi-he, WU Chang-feng. Advances in application of materials of super-resolution imaging fluorescent probe[J]. Chinese Optics, 2018, 11(3): 344-362. doi: 10.3788/CO.20181103.0344
    • 纳米技术与生物医学的快速发展和交叉融合促使许多传统学科产生了革命性的变化,形成了纳米生物医学这一交叉热点领域。将新兴的纳米技术应用于细胞生物学、肿瘤生物学及临床医学是目前纳米生物医学的研究重点[1-2]。当前,对于生命系统的认识已经深入到单细胞、单分子水平,迫切需要在分子水平上对细胞的微观结构及生物大分子的动态行为进行实时观测和分析[3-5]。一方面,人们希望能精密测量活细胞内生物分子的三维空间分布;另一方面,研究者也希望准确理解细胞内发生的各种动态过程:如蛋白质-蛋白质之间如何发生相互作用及其时空结构;结构蛋白与核酸等如何组成细胞的基本结构体系;重要的活性因子如何调节细胞的增殖、分化、凋亡与信号传导等生命活动。反映这些体系结构功能的特征尺度都在纳米量级,如何在纳米尺度上实时观测活体细胞的精细结构及动态行为,对于生物医学及生物信息科学等诸多研究领域都有重大意义。

      典型的生物成像技术中,正电子发射断层扫描(Positron Emission Tomography, PET)、光学相干成像(Optical Coherence Tomography, OCT)以及磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)等技术应用到人类以及动物模型成像中主要受限于空间分辨率(~1 mm到10 μm)。电子显微镜(Electron Microscopy, EM)恰好相反,能够提供分子量级的空间分辨率, 该技术与生物样品的不兼容性以及真空成像环境等因素,只能对感兴趣的区域提供单一的成像而不能提供动态的活细胞成像过程。荧光显微镜(Fluorescence Microscopy, FM)利用荧光探针对生物分子进行特异性标记,通过监测荧光信号实现可视化成像,在过去的几十年中,已经成为活细胞、组织中生物分子特异性定位、相互作用以及亚细胞活动过程等研究的重要工具。荧光显微镜最大的优势在于其对活细胞的兼容性,能够进行动态无损伤的生物成像实验。随着新型荧光探针和成像理论的发展,研究人员开发出了突破光学衍射极限的三维超分辨率荧光成像技术。超分辨成像技术可以以纳米尺度空间分辨在活细胞内观察到亚细胞结构和动态行为,极大地推动生命科学的进一步发展。

      Eric Betzig教授,William Esco Moerner教授和Stefan Walter Hell教授因在超分辨率成像技术中突破性和原创性的贡献而获得了2014年诺贝尔奖。和近场光学相比,由于物镜与样品之间的距离比光波长大得多,超分辨率成像属于远场光学显微技术。突破光学衍射极限的关键在于调节荧光探针分子在两种状态之间转变(荧光态和非荧光态)。本文对不同超分辨荧光成像技术原理进行介绍并总结近期广泛应用在生物学研究中的超分辨荧光探针材料的发展。

    • 在分辨率上,荧光显微镜提供了独特的空间和时间分辨率选择(如图 1所示)。然而,传统光学显微镜的分辨率受限于光学衍射极限,其分辨率通常是所用光波长的一半。这表明,即使在配备高数值孔径(N.A.)物镜的高精度宽场显微镜上,应用可见光最高只能达到200 nm的分辨率(阿贝定律)[6]。因此,受空间分辨率的限制,生物学中几十到几百纳米的空间范围的诸多亚细胞基础过程都无法通过传统的光学显微镜可视化研究。与传统的光学显微镜相比,超分辨率技术能够提供近10倍高的分辨率[7]

      图  1  不同生物成像技术空间分辨率对比图

      Figure 1.  Spatial resolution comparison of different biological imaging techniques

      根据成像技术的原理,超分辨成像可分为四大类:

      (1) 基于光学非线性效应调控、压窄点扩散函数(Point Spread Function, PSF)的超分辨显微成像技术(PSF Modulation)。包括受激发射损耗显微成像技术(STimulated Emission Depletion,STED)[8-10]、基态损耗(ground state depletion, GSD)、可逆饱和光学荧光跃迁超分辨显微成像技术(REversible Saturable Optical Fluorescence Transitions,RESOLFT),等[11-13]

      (2) 基于单分子定位(Single-Molecule Localization Microscopy,SMLM)的超分辨显微成像技术。包括光激活定位显微成像技术(PhotoActivated Localization MicroscopyPALM)[14-16]、(直接)随机光学重构显微成像技术((direct) STochastic Optical Reconstruction Microscopy(d)STORM),等[14, 17-18]

      (3) 基于荧光分子随机涨落(Fluctuation/Blinking)的超分辨显微成像技术。该类技术包括随机光学涨落超分辨显微成像(Super-resolution Optical Fluctuation ImagingSOFI)、贝叶斯超分辨显微成像(Bayesian Analyisi of Blinking and Bleaching3B)[19-21],等。

      (4) 基于频域处理的超分辨成像技术。该类技术主要包括:结构光照明显微成像技术(Structured Illumination MicroscopySIM)和饱和结构光照明显微成像技术(Saturated Structured Illumination MicroscopySSIM)[22-23]

      这些突破性的思路将光学显微镜的分辨率提升到纳米尺度。随着超分辨率成像技术的出现,用于超分辨率成像的荧光探针材料在化学与生物化学研究中显得尤为重要。对于STED显微镜,材料在较强的STED激光束照射下要具有足够好的光稳定性且具备受激发射的能力;PALM和STORM/dSTORM要求荧光探针材料具备光激活或光闪烁特性,用来拍摄荧光照片序列并进行单粒子定位和图像解卷积过程;对于SOFI来说,材料在激光激发下,需要具有快速的荧光强度涨落特性,通过计算图像时间序列上荧光分子的累积量来实现超分辨成像。到目前为止,用于优化超分辨成像性能的智能荧光材料(荧光蛋白,以及荧光小分子染料和纳米材料等)已经揭示了诸多传统荧光显微镜不能分辨的亚细胞结构及生物过程。本文对不同超分辨技术原理进行介绍并总结近期广泛应用在生物学研究中的超分辨荧光探针材料的发展。结构光照明超分辨成像(SIM)对荧光探针无特殊要求,荧光探针的可选范围较广,但本文不对SIM成像的荧光探针进行总结。

    • STED显微镜技术由Stefan Walter Hell教授提出并付诸实践[8, 24]。传统荧光显微镜中,在激发光照明下,激发态的荧光探针分子通过自发辐射而发射荧光形成衍射极限图像。在STED显微镜(基于扫描共聚焦显微镜的扫描方式)中,引入第二束激光(STED光束)将原本自发辐射(寿命约为几纳秒)的荧光分子通过受激发射过程将其激发态快速损耗到基态。环形的STED激光束使处于两束激光交叠区域的荧光分子被损耗掉,处在焦平面STED环形光中心区域的荧光点便是被压缩了的点扩散函数(PSF),以此提高分辨率[25]。由于STED激光对荧光分子具有再激发效应,因此STED光波长应该远离吸收波段,但要在荧光发射的附近位置(如图 2所示)。STED是一种确定性的功能技术,利用荧光团的非线性响应,在衍射极限以下达到更高的分辨率。

      图  2  STED超分辨显微镜原理示意图[25]

      Figure 2.  Basic light-pathway diagram and the principle of STED microscopy[25]

      由于环状STED光的面积理论上可以通过不断增加其光强进行无限增大,因此,激发区域的光斑可以无限小于衍射极限,最后通过扫描的方式进行成像。STED的分辨率公式为:

      (1)

      式中,IS是荧光染料的饱和受激辐射强度,定义为探针材料荧光发射强度被损耗到一半时的STED光强度;I表示STED光强度。由公式(1)可知,随着STED光强的增加,理论上可以无限增加分辨率。在实际实验过程中,荧光分子的饱和光强范围为10~100 MW/cm2,为了获得较高的空间分辨率,实验中需要足够强的STED光功率密度,对样品的光损伤和光漂白影响较为严重[26-28]。为了降低对样品的光损伤和光漂白的影响,与STED类似的成像技术得到进一步的发展,其中包括基态损耗(Ground State Depletion, GSD)等不同方式的超分辨率荧光显微成像技术[29-30]

    • 在光学显微成像实验中,通常选取红光发射的荧光探针,由于其需要较低的激发光子能量以及极低的背景干扰。特别是罗丹明类的衍生物ATTO647N,由于具有较高的量子效率和较大的消光系数,在STED显微镜中使用最为广泛。此外,另一种红光发射的染料KK114,具有较好的光稳定性和较好的水溶性,在STED显微镜中的应用同样比较广泛。由于KK114是带负电荷的染料,不能透过细胞且NHS酯的稳定性较低等缺陷抑制了其应用。为了避免这些缺点,Wurum等人设计合成一系列具有高量子效率且改进了NHS酯稳定的新型红光罗丹明染料(如图 3所示)。该系列探针能以较高的对比度实现低于25 nm的STED空间分辨率的细胞成像[31]

      图  3  红光发射的罗丹明荧光分子结构式

      Figure 3.  Chemical structures of red-emitting rhodamine fluorophores

      为了能够达到较高的成像分辨率,STED显微技术需要一个高功率的STED激光作为第二光源去擦除非靶标处的荧光。因此,具有大斯托克斯位移的荧光分子受到了青睐,因为此类荧光分子受激发射光的波长可以和自发辐射的荧光波长明显区分,有利于对中心亚衍射极限的荧光斑点信号的收集。Hell等人设计合成了一系列基于香豆素分子结构的衍生物荧光探针,这些探针具有较好的光稳定性、较高的荧光亮度和大的斯托克斯位移(如图 4所示)[32]。分子1是通过1-(3-羧基丙基)-4-羟甲基-2, 2-二甲基-1, 2-二氢喹啉片段与香豆素荧光分子和3-[2-(2-吡啶基)乙烯基]残基耦连得到的。其吸收和发射峰位分别在472 nm和623 nm。分子中的磷酸基团用来增强了染料分子的亲水性和荧光量子产率,同时减少了非特异性结合。此外,活性羧酸基团用来生物耦连以实现免疫荧光标记实验。分子1d (Star470SX+)是红光发射的香豆素类荧光染料,通过二抗标记实现对高尔基体网络中cis-Golgi和trans-Golgi精细可区分的多色STED超分辨成像,其光学分辨率约为70 nm。

      图  4  用于STED荧光显微镜的荧光分子1及其衍生物结构式

      Figure 4.  Chemical structures of fluorescent molecular 1 and derivatives used in STED microscopy

      为了更加精细的识别细胞器结构功能和动力学过程,荧光探针除了应该具有足够的光稳定性、高荧光亮度以及能与活细胞相容等性质外,细胞渗透性和较低的光毒性同样至关重要。Schepartz等人[33]发展了一种基于脂质的策略以克服高尔基体的结构成像和动力学过程的挑战。该方法是在活细胞超分辨成像中引入生物正交反应。通过两步过程进行实验标记:用含有高尔基靶向官能基团的反式环辛烯(Cer-TPO)的神经酰胺脂质处理细胞,高荧光亮度、含有四嗪标记的官能团的近红外发光染料SiR-Tz (分子2)用来特异性识别Cer-TCO,硅-罗丹明分子(SiR)用来显示荧光信号(如图 5所示);当两种分子在高尔基体内接近时,四嗪和反式环辛烯通过无铜点击反应快速连接在一起,反应生成具有较好光稳定性的染料Cer-SiR(分子3),从而有助于3D荧光成像和STED超分辨高尔基体的成像分析。

      图  5  荧光分子2和3的化学结构式及在活细胞中的正交反应示意图

      Figure 5.  Chemical structures of fluorescent moleculars 2 and 3 and the bioorthogonal reaction in live cells

      由于硅-罗丹明(SiR)衍生物(如图 6所示,分子4)具有高荧光强度,低光毒性以及环境依赖的OFF态(非荧光螺旋体)/ON态(荧光两性离子)转化的行为,能够明显的区分它们与极性蛋白质表面非特异性结合(ON态)到疏水表面(OFF态)的变化过程。分子4在聚集态是无荧光的OFF态。Johnsson等人[34]根据这种性质开发了两套由SiR衍生物与多西他赛(分子5)和脱溴去甲基茉莉酮酸(分子6)组成的荧光探针(如图 6所示),对活细胞中的细胞骨架结构进行超分辨率成像。Hell等用荧光分子6作为探针,首先报道了活细胞中海马神经元轴突中树突状皮质下肌动蛋白的存在,该结果与早期电子显微镜实验结果一致[35]。损耗光波长处在近红外区域的荧光探针光稳定性好,ON/OFF的转换效率高,降低了光散射并且对生物组织无毒。Hell等人设计了一系列基于分子7的探针(如图 6所示),该类探针光稳定性好,水溶液中量子效率高,吸收和发射峰位分别处在600 nm和680 nm。与常用的罗丹明染料(λ=750~770 nm)不同,这些小分子量的荧光探针(分子量小于600)在STED显微镜中,使用长波长(λ=800 nm)的损耗激光使成像性能获得关键的提升[36]

      图  6  荧光分子4~7的化学结构式

      Figure 6.  Chemical structures of fluorescent moleculars 4~7

      在典型的扫描STED显微镜,荧光分子的吸收截面常为10-16·cm-2,激发态寿命为几纳秒,STED光强度常用3~10 MW·cm-2。在扫描的过程中,荧光被STED光损耗掉的荧光分子在需要发光时能够快速恢复。只有当其保持在S0或S1状态时,才能确保及时的恢复荧光发射。通常,不希望过渡到更高的激发态Sn(nυ>1)或三线态,荧光分子不能经历长时间的暗态或光漂白,因此牺牲了光稳定性。通过特殊的氧化还原系统(ROXS, 还原剂抗坏血酸或Trolox;氧化剂甲基维生素或Trolox-醌)可以显著提高荧光分子的光稳定性。在氧化还原反应缓冲溶液中形成了自由基阴离子和阳离子,激发的三线态的荧光分子被快速退激发掉。随后的自由基物质会进一步通过整体氧化还原反应回落到单线态基态。Sauer等人通过这种方法提高了ATTO647N的光稳定性并且使空间分辨率提高了几倍(<30 nm)。用甲基紫精-羧酸作为氧化还原缓冲液,在63 mW的750 nm STED光擦除下,单个ATTO647N分子图像的精度达到了1.8 nm[37]。Johnsson等人通过调节SiR官能团,在SiR650的基础上发展了一系列的用于亚细胞结构(微管结构、溶酶体、肌动蛋白)靶向的SiR700的荧光探针,并实现了100 nm的结构光成像和约50 nm的STED细胞微管成像[38]

      目前,小分子荧光分子由于其优异的特征,仍然是STED显微镜的主要荧光探针。为了拓展STED显微镜的应用范围,Hell等使用商用的CdSe/Zns和CdTe/ZnS核壳结构的红光发射量子点(Qdots)作为STED的荧光探针,其STED激光波长为775 nm,实现了对Qdots标记的成纤维细胞波形蛋白片段的50 nm的空间分辨率的成像[39]。Qdots较好的光稳定性能够保证可以重复扫描1 000帧以上的图像而不降低图像对比度;因此Qdots可作为较长时间成像的荧光探针。

    • 克服衍射极限造成的分辨率限制的另一种方法是基于荧光团在ON状态(荧光)和OFF状态(非荧光)之间随机切换特性的超分辨荧光显微镜。该方法主要是通过特定时间的光诱导下探测随机激活荧光团(有机荧光染料和荧光蛋白)的一系列荧光信号。荧光分子在组合激光(激活和激发光束)的照射下能够光转换。荧光分子的随机光开关性质在每帧图像产生稀疏的荧光信号,通过二维的高斯函数拟合的分析算法对荧光团精确定位。最后,通过对所有的单个激活的荧光团的位置叠加重建出超分辨荧光图像。该方法的核心在于利用二维高斯函数来拟合出单个荧光分子在宽场荧光显微镜下的位置。定位中心的误差,即定位精度,可由公式(2)给出:

      (2)

      式中,s为点扩散函数的标准方差,a为探测器CCD像素的大小(单位:nm),N为收集到的光子数,b为背景噪声。单分子定位的理论分辨率为[40]

      (3)

      根据公式(2)和(3)可知,如果荧光探针发射的光子数越多,荧光成像过程中引入的背景噪声就越小,定位精度越高。对于生物荧光探针来说,单个荧光蛋白分子能够被有效检测到的光子数约为几百个,而单个荧光染料分子为几千个。因此,定位精度可以达到几纳米的范围。通过重建数千帧荧光图像获得单个高空间分辨率图像,用时间分辨率来换取空间分辨率。因此,要想获得超分辨率图像,荧光探针材料的性能至关重要。PALM和STORM技术的工作原理比较类似[14, 17],但是分别使用不同的荧光探针(如图 7所示)。PALM技术使用的荧光探针是在完全光漂白之前能够完成一次或几次光转换或光激活循环的过程的荧光蛋白(FPs)或有机荧光分子,STORM技术使用的则是可逆光转换的有机荧光分子作为荧光探针[41-43]。PALM和STORM技术都是通过宽场显微镜上配备的灵敏的面阵探测器探测荧光分子的发光并结合单分子定位的图像重构技术。

      图  7  光激活定位显微镜和随机光学重构显微镜工作原理及亚细胞结构超分辨图(左侧:PALM及COS-7细胞溶酶体超分辨图像;右侧:STORM原理图及亚细胞结构单色、多色超分辨图像)[14, 17]

      Figure 7.  Working principle of Photoactivation Localization Microscopy, Stochastic Optical Reconstruction Microscopy and subcellular structure super resolution images(Left: PALM and COS-7 cell lysosomal superresolution images; right:STORM schematic and subcellular structure monochrome, multicolor super-resolution images)[14, 17]

    • 在活细胞超分辨率成像中,荧光蛋白(FPs)因具有基因编码的靶向能力且容易开发,仍然是不可或缺的生物荧光探针的选择[41, 44]。与此同时,过去的几十年中,有机荧光分子由于具有独特的光谱可调性、溶解度和靶向特异性等优点在超分辨率显微成像技术中得到了广泛的应用。如前所述,在超分辨率成像中有机荧光探针的发射是通过可逆的光转换来实现的。Moerner等人设计了一种有机荧光分子(如图 8所示,分子8), HaloTag与叠氮基-二氰基亚甲基二呋喃(DCDHF)结合,用在固定的细胞以及活细胞成像中精确标记细胞蛋白[45]。Moerner等人使用分子8成功实现了细胞骨架蛋白(Popz、FtsZ和AmiC)的PALM超分辨率成像。随机和可逆的光激活在分子内部是一个推挽过程,含氨基的DCDHF(如图 8,分子9)具有高亮度,适用于超分辨率成像。将氨基替换成硝基可以提高DCDHF在超分辨成像中的响应。在硝基还原酶(NTR)和电子给体(NADH)的存在下分子10中所含的硝基被还原; 因此该分子在实验期间不需特殊处理并且不存在光依赖的激活(如图 8)等优点。该分子在活细菌细胞内硝基还原酶的超分辨率成像中数据采集时间低于10 min[46]

      图  8  荧光分子8~10的化学结构式

      Figure 8.  Chemical structures of fluorescent moleculars 8~10

      2007年,S.W.Hell等人报道了罗丹明荧光分子(如图 9所示,分子11, SAR577)可用于基于单分子光转换的荧光纳米显微镜。在紫外光(单光子情况下)或者是双光子激光照射下,SAR577在安非他酮内酯(无荧光)和两性离子形式(荧光)之间进行光开关转换。该类分子处于荧光态时可发射足够多的光子,在活细胞中获得较高的空间分辨率图像。荧光态和暗态光强度的高对比度使之在高密度标记的样品中获得精细的结构图像。利用这种方法,轴向可获得0.5~1 μm的光学切片,提高了基于单分子显微镜技术多层成像的适用性。应用PALM荧光显微镜,利用包覆了不同荧光分子(SPA545, SRA577, SRA617)的二氧化硅纳米球实现了15 nm空间分辨率和多色超分辨成像[47]。另外,SRA577-NHSS和含有马来酰亚胺的SRA552罗丹明类似物能够实现哺乳动物细胞中微管和角蛋白网络的多色单分子定位超分辨成像。在细胞生物成像实验中,长时间的紫外光照射对生物样品有较大的损害。Moerner等人调控了传统的使用紫外光照明的光转换罗丹明荧光分子,得到了一系列的可见光激发的罗丹明衍生物(如图 9所示,分子12~21)。此外,他们在荧光团的内酰胺氮上引入了各种共轭发色团,在不对其光物理性质产生影响的情况下降低光活化所需的能量。新的荧光分子进一步功能化后,特异性标记分布在革兰氏阴性新月牙菌的活细胞表面上的胺。应用PALM显微镜在低能量激光(405 nm)下成功的标识出了10~20 nm的二维和三维的细胞表面[48]

      图  9  罗丹明衍生物(11~21)光诱导转换过程分子结构式

      Figure 9.  Photoinduced reversible switching process of rhodamine derivatives(11~21)

      基于罗丹明分子结构,Lavis等人发展了一种将季碳原子替换黄嘌呤氧的方式合成荧光素的红移同构体和罗丹明110,命名为Carbofluorescein(如图 10所示,分子22)和Carborhodamine110 (如图 10所示,分子23),优异的光谱性质和光稳定性使得它们可以用于高对比度成像应用。此外,为了比较PALM显微镜对活细胞成像的质量,通过连接一个对光不稳定的结构,合成了含有鬼笔环肽的Carborhodamine110类似物(如图 10所示,分子24),实现了老鼠成纤维细胞肌动蛋白的成像。与商用的鬼笔环肽AlexaFluor647(AF647)相比,分子24光子产量高,成像对比度高,并且能够提供比AF647高两倍的定位精度[49]

      图  10  Carbofluoresceins,Carborhodamines110的分子结构式

      Figure 10.  Chemical structures of carbofluoresceins, carborhodamines110(28)

      半花青染料,由于具有光致变色的光诱导荧光转换行为,在超分辨率成像显微镜领域受到广泛的应用。Raymo等人研究了半花青荧光分子的化学结构和光转换性能之间的关系。设计了一系列的基于半花青的荧光分子(如图 11所示,分子25~29)。该类分子是基于2, 3, 3-三甲基-3H-二氢吲哚与另一种发色团(如联苯,花青或芘)结合的季铵盐。将2-羟基-5-硝基苄基连接到染料的N-位上,在紫外线和可见光照射下能够使之在暗态与荧光态之间转变。将单分子染料装载到有机聚合物中制备形成纳米粒子并用到超分辨成像中,该类荧光探针具有较好的单粒子荧光闪烁特性,空间分辨率能够达到28 nm[50]。Hu等人利用光致变色荧光分子通过超分辨显微镜验证了聚合物纳米粒子中的核壳结构和定位模式[51]。首先,将分子30共轭偶联到双亲性聚合物材料上,然后将聚合物包覆在碳酸钙壳层中,得到核壳纳米结构材料(如图 11所示)。通常,荧光分子处于非荧光的螺吡喃形式。在365 nm光照射下转换为荧光态,在561 nm的可见光照射下转换到螺吡喃形式;由于提高了聚合物负载分子的密度,实验数据采集时间由之前的几小时缩短到几分钟,实现了更快速的PALM显微成像。Zhang等人使用花青染料设计了基于超分辨成像的传感器探针(如图 11所示,分子31),用来定量活细胞中的微管蛋白。在结合微管蛋白之前,分子31处于暗态(如图 11所示,分子32)。选择性结合,后在375 nm照射时荧光发射增强,分子31可以在20 nm的空间分辨率下检测微管蛋白位点的选择性[52]

      图  11  分子25~32开关过程的化学结构式以及通过荧光分子31实现的细胞超分辨率图像;紫外光照射下分子34的光开关转换过程[52-53]

      Figure 11.  Chemical structures and the switching process of 25~32 and superresolution images obtained with 31 in live cells. Photoswitchable process of 34 under irradiation with UV/visible light[52-53]

      为了进一步丰富适用于PALM显微镜的新荧光材料,Zhu等人开发了一种pH-敏感、具有光开关性质的水溶聚合物纳米系统(如图 11所示,分子34)对酸性的溶酶体超分辨率成像。分子34中的聚-N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)作为载体材料来调节亲水性,萘二甲酰亚胺(NI)作为pH敏感单元,光敏性的二甲基亚乙烯(DTE)用来调节荧光闪烁特性。该聚合物材料被活细胞内吞后首先定位到溶酶体。酸性溶酶体将聚合物的暗态转换为荧光态(分子33)。交替的光照射调节聚合物的光闪烁,实现了40 nm空间分辨率的超分辨成像[53]

    • Zhuang等人在2008年报道了一系列可开关的荧光探针,来实现多色随机光学重构显微镜(STORM)。荧光探针由活化剂(例如:Alexa405,Cy2,Cy3)、能量供体和能量受体(如Cy5)组成,可在ON/OFF之间循环开关并应用到多色STORM超分辨成像[54]。进一步地,应用到DNA多色超分辨率成像,能够在纳米尺度直接观察分子间相互作用。此外,她们将这种方法扩展到细胞内,实现了微管和网格蛋白有被小窝的超分辨率STORM成像。在探测光路中配置一个半圆柱透镜,通过其散光来确定每个独立荧光分子的轴向和横向的位置,然后重复光开关过程。这种方式能够获得20~30 nm的侧向和50~60 nm的轴向分辨率的三维成像(如图 12所示)[55]

      图  12  (a~c)3种不同DNA结构的三色STORM图像(Alexa405/Cy5, Cy2/Cy5和Cy3/Cy5标记;405 nm, 457 nm和532 nm激光激发);(d)Alexa647/Cy3标记的BC-S-1细胞内网格蛋白凹坑(CCPs)的三维STORM图像[54-55]

      Figure 12.  (a~c)Three-color STORM images of three different DNA constructs(labelled with Alexa405/Cy5, Cy2/Cy5, and Cy3/Cy5, activated using 405, 457 and 532 nm laser, respectively); (d)3D STORM image of clathrin-coated pits(CCPs) stained with the Alexa647/Cy3 in BS-C-1 cells[54-55]

      与之前STORM技术使用荧光蛋白或荧光分子对(激活剂和荧光报告分子)作为探针不同,Sauer等用常规荧光分子作为荧光探针,使用不同波长的光激发实现光转换来进行超分辨成像,并将这种技术命名为直接随机光学重构显微镜(dSTORM)。使用市售的荧光探针(如图 13所示,分子35),可以在几分钟的时间内获得细胞内蛋白质的20 nm dSTORM成像[56]

      图  13  花青染料(35~40)分子式和假设的闪烁机制

      Figure 13.  Chemical structures of cyanine dyes(35~40) and the proposed photoblinking mechanism

      花青染料在荧光态具有较高的光子发射产率而被看作是理想的STORM荧光探针。适当的pH下,在初级硫醇(b-甲基乙醇)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)存在下,花青染料转化为暗态。通过电子离子化液相色谱-质谱(ESI-MS)检测到硫醇共轭π-电子的破坏,分子中巯基和TCEP加入后,形成了新产物(如图 13所示,分子37和38)。将非荧光加合物通过紫外光照射可逆的转化为分子36的发光形式[57-58]。Squier等通过FRET对(如图 13所示,分子39)检测细菌细胞中的四半胱氨酸蛋白。该探针由含双砷的Cy3-Cy5能量转移对组成,Cy3作为能量供体(激活剂),接收Cy5的荧光做超分辨成像。与靶蛋白(如,RpoA*)共价连接后,由于Cy3聚甲炔链的刚性运动,有明显的荧光增强(Cy5, 20倍的增加)。STORM能够以20 nm的空间分辨率识别单个分子[59]。Haynes等使用市售的Alexa Fluoro 488激活的羧酸酯对革兰氏阴性细菌表面外膜蛋白标记,得到了30~40 nm的STORM定位精度[60]。Gianneschi等人开发了对金属蛋白酶(MMP)有响应、Alexa647标记的肽-聚合物两亲物(PPA)纳米粒子(如图 13所示,分子40),来研究HT-1080人纤维癌中胶束的累积和增强的滞留行为[61]

      Sauer等人报道了一种基于市售的罗丹明和恶嗪(Alexa和ATTO)(如图 14所示,分子41~48)的荧光分子,在生理环境下实现了简便的超分辨率成像方案。使用各种硫醇(b-巯基乙胺(MEA)、二硫苏糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH))作为还原剂,通过增加暗态的寿命来选择性的抑制激发三线态。实验过程中,氧气和氧化剂的存在确保荧光探针转换到荧光态。此外,使用市售的有机荧光分子通过该方案实现了对活细胞RNA的超分辨成像[62]。为有机小分子荧光探针分子应用到多色超分辨成像开辟了新的途径。

      图  14  STORM荧光探针41~48结构式及细胞微管的超分辨图像[62];Si-罗丹明荧光分子(49~55)衍生物以及分子54在合适pH环境中闪烁机制的模型及相应的化学结构式[65]; ATTO655标记的CCR5在水和重水不同环境下,分子56和57在光照时互相转化过程以及亚细胞结构图像[66]

      Figure 14.  Chemical structures of fluorescent dyes(41-48) used in STORM[62]; Chemical structures of 49-55 and proposed photoblinking mechanism of 54 in a suitable pH environment[65]; Photoswitching between 56 and 57 upon photoirradiation in the presence of oxygen and ATTO655-labelled CCR5 imaging of live cells in H2O and D2O[66]

      如前所述,理想的活细胞成像荧光探针应该具有高光子通量的光转换或光激活性质,在近红外吸收和发射,以及较高的膜渗透性,这样最有利于对细胞内蛋白质标记研究。Johnsson等人提出了一类新的SiR荧光探针(如图 14所示,分子50~53),这些荧光分子具备以上提出的所有要求并且容易合成,用于活细胞和组织中蛋白的特异性成像。另外,含有羧基的SiR分子在低介电常数的溶剂中处于螺内酯形式的暗态,其光闪烁性质能够用于STORM成像。使用如图 14所示的分子50(SiR-SNAP)、51(SiR-CLIP)和52(SiR-Halo)荧光探针实现了对Hela细胞的蛋白的高效多色荧光标记[63]

      Urano等人开发了一类SiR荧光分子(如图 14所示,分子54),该荧光分子无论在硫醇的存在与否和辐照强度如何,都能够实现自发光闪烁。在生理pH环境下,羧甲基-SiR(HMSiR)处于己内酯形式的暗态(如图 14所示,分子54)。在激发光照射下,处于两性离子形式的荧光态(如图 14所示,分子55),其中的一些开始自发的闪烁,且荧光发光时间足以用于检测。使用分子54,实现了核孔结构的单分子定位成像和活细胞内结构的追踪[64]

      在基于单分子的超分辨显微镜中,通常使用基于酶的除氧系统或通入惰性气体的方式来提高荧光分子的光稳定性以及调节荧光分子的光开关和最佳荧光响应。Doose等人证明亚甲基蓝(MB)-硫醇可用作高效快速的除氧系统。在光照下MB生成活性氧(ROS)MB+,在适当的还原剂存在下,MB+可以进一步被还原成MBH达到了消耗分子氧的目的。使用Cy5标记的抗体,Doose通过dSTORM显微镜在Hela细胞微管中研究了MB-硫醇作为超分辨成像的除氧剂的重要作用[65]

      通常,市售的红光发射的有机荧光探针量子产率低、发光亮度有限。Furstenberg等人报道了一种增强了商业荧光分子的荧光量子效率的方法。该荧光分子可以在氧化态(如图 14所示,分子56)和还原态(分子57)之间转化。将缓冲溶液中的水替换成重水(D2O)量子效率提高了两倍。这主要是由于在无辐射跃迁的过程中,氢键辅助失活从而减少荧光淬灭过程。此外,使用这种方法还对ATTO655标记的趋化因子受体5(CCR5)的结构实现了20 nm空间分辨率的超分辨成像(dSTORM)[66]

    • 2009年,Dertinger等人发展了一类新型的超分辨率成像技术,被称为超分辨光学涨落成像(SOFI, 如图 15所示), SOFI是基于相互独立的荧光发色团荧光强度的随机涨落来实现分辨率提高的成像技术[19]。荧光材料只需在激光照射下产生荧光强度的涨落而不需要具有OFF-ON的状态转换。通常,可以利用氧化还原反应的缓冲溶液(如dSTORM)或荧光发色团本身的光转换(可光转化的荧光蛋白和量子点等)来实现荧光强度的涨落。首先拍摄一系列的荧光图像序列,然后进行随时间的波动的高阶统计分析,找出每个发色点的独特的强度波动曲线。在检测特征的波动曲线时,可以将单个荧光分子彼此区分开。SOFI适用于高阶累积量来重建超分辨率图像[19]。如果能够探测到足够多的光子数,累积量的阶数越高,则能够得高更高分辨率的图像。

      图  15  SOFI成像原理示意图及使用Qdots标记的细胞微管SOFI图像[19, 67, 72]

      Figure 15.  Principle of SOFI imaging and SOFI images of cell microtubule labeled with Qdots[19, 67, 72]

      假设一个生物结构由N个独立发光的荧光分子标记,其荧光分子的荧光强度在时间上随机、独立进行闪烁或波动,那么在空间位置r、时刻t时的荧光信号强度I可以表示为[19]

      (4)

      式中,k表示荧光分子的荧光强度,U(r-rk)表示位置rk荧光分子处的光学系统的点扩散函数(PSF)。Sk(t)表示第k个荧光分子在时刻t的归一化的时间随机波动函数,b(r)表示背景噪声,n(r, t)表示图像的噪声。

      通常显微镜光学系统的PSF表示为式(5):

      (5)

      不同荧光分子rk的荧光强度在时间维度上是随机且独立的,因此,不同荧光分子荧光强度在时间序列上的互相关运算值为0。SOFI技术是通过计算探测器上每个像素点的荧光波动的n阶累积量函数(Cumulant Functions, CF)。探测器上的荧光闪烁表示为式(6):

      (6)

      式中,〈I(r, t)〉t表示t时间内荧光信号强度的平均值。n阶累积量函数为式(7):

      (7)

      由于系统噪声和背景在时间序列上是随机的没有相关性,因此n阶累积量可以消除背景及噪声的影响。对于一个2阶相关函数则可以表示为式(8):

      (8)

      从2阶相关函数可以看出,rk处的PSF在三维上被压缩了倍。这样三维的分辨率提升了倍。此时的PSF表示为式(9):

      (9)

      通常,SOFI的处理过程是计算互累积量,这样能够进一步的消除了使用自相关运算过程中产生的散粒噪声的影响。使用傅里叶加权法(Fourier reweighting)、反卷积SOFI的PSF等方法,可以实现n阶累积量计算达到三维分辨率n倍的提升[67-71]

      SOFI显微术能够在三个维度同时提高对比度。该技术具有简单、快速、曝光时间短以及对设备要求低等优点。唯一的要求是用于标记的荧光分子具有能够重复、随机的荧光闪烁特性。通常,适用SOFI成像的探针包括荧光蛋白(FP)、无机量子点(Quantum Dots, Qdots)以及有及有机荧光小分子(Organic Dyes)等。2009年,T.Dertinger等使用具有荧光闪烁特性的Qdots625对Hela细胞微管结构进行特异性标记并在国际上首次实现了SOFI成像应用[70],此后一段时间内,研究人员通过Qdots525、Qdots705以及Qdots800等对SOFI成像从技术上进行优化,实现了通过计算n阶累积量得到n倍的分辨率提升,以及发展了高密度标记的JT-SOFI等技术等[67, 69, 72]

    • 可逆光开关荧光蛋白(RSFPs)是超分辨显微成像技术中的一种常用荧光探针,成为国际上的研究热点。其中以绿色可逆光开光荧光蛋白Dronpa为代表的RSFPs被广泛地应用在各类超分辨显微成像中,例如RESOLFT、PALM、SOFI等超分辨显微成像以及各类生物问题研究中[73]。Dronpa的最大激发波长约为500 nm,最大发射波长约为520 nm,在488 nm光的照射下,Dronpa由绿色的亮态转变为暗态,随后在405 nm光的照射下可迅速恢复至亮态,继续发出绿色荧光,这一过程可以转化多次,从而通过不同波长的光实现反复光开关功能。对于荧光蛋白的活细胞SOFI超分辨显微成像,2012年,Peter Dedecker首次提出利用Dronpa和红色可逆光开光荧光蛋白rsTagRFP实现双色活细胞SOFI超分辨显微成像[74]

      目前, RSFPs的品种较为单一,常用的绿色RSFPs Dronpa的荧光光子数较低,光学稳定性有待提高[74]。Sun等人选择了单分子光子数更高的光转化蛋白mEos 3.1作为模板[75],对His62位点进行饱和位点突变,获得了更适合用于活细胞SOFI的荧光蛋白Skylan-S,实验结果表明Skylan-S的亮度是Dronpa的1.15倍,光稳定相比Dronpa更加优异,并且荧光波动范围更大,在多项参数上超越Dronpa成为新一代活细胞SOFI成像的荧光探针[76]

      为了使SOFI显微术可以与有机荧光染料兼容,Dertinger等人使用和dSTORM相同的条件,使用EMCCD作为探测器, 在光照射下具有快速荧光闪烁性质的Alexa647作为荧光探针。在20 Hz的帧率下拍摄1 000张Alexa-647偶联抗体标记的COS-7细胞β-微管。使用SOFI算法运算处理之后,得到的图像表明,SOFI技术可以在较低的成像时间上获得具有低背景、高分辨率的荧光图像[77]

      基于单分子定位的超分辨成像技术已经能够显著提升空间分辨率;然而,当多个荧光分子靠近之后,其光开关过程的区分会受到限制,从而导致不能够高密度标记亚细胞结构限制了对活细胞成像。为了解决这个问题,Xi等人发展了一种联合标记超分辨技术(JT-SOFI),从而实现高密度标记且不影响目标结构的空间分辨率和结构的完整性。为了获得超高密度标记,他们使用具有不同发射波长的市售量子点QD525、QD625和QD705来共同标记COS-7细胞中的微管蛋白(图 25)。在分析了具有窄带发射光谱宽度的QD标记的荧光闪烁图像之后,在亚衍射分辨率下精确的获得了微管网络的高对比度图像。与SOFI相反,JT-SOFI提供了一个高分辨率的连续微管网络结构,每个通道只有100帧,从而提高了时间分辨率[72]

      聚合物量子点(Pdots)作为新一代优秀的生物荧光探针在荧光成像示踪分析技术中得到广泛的应用。此前,受限于众多因素,Pdots从未实现过超分辨成像。为了实现高量子产率,超高光稳定性和优异的生物兼容性的荧光探针,同时满足超分辨成像的要求,Wu和合作者Sun等人成功设计制备了小尺寸光闪烁半导体聚合物量子点,特异性地对生物亚细胞结构进行高密度标记,取得超分辨率光学涨落成像(SOFI)结果。Pdots的荧光闪烁特性主要源于聚合物分子内的能量迁移的动态过程(主要是空穴极化子对荧光的淬灭[78-79]。因此,Pdots的尺寸、形貌、激子动力学以及能量传递过程等因素都会影响其荧光闪烁特性。前期的单粒子荧光性质研究表明,尺寸大于15 nm的Pdots表现出连续稳定的荧光动态过程;而10 nm左右的小尺寸Pdots表现出具有明显的荧光闪烁(Photoblinking)特性[80-82]。该工作选用两种具有较高荧光强度的聚合物PFBT和CN-PPV (如图 16所示,分子58, 59)。通过优化传统的纳米再沉淀法制备出分布较均一的两种小尺寸Pdots,均表现出较高的荧光亮度以及荧光闪烁特性。单粒子荧光实验统计表明,两种小尺寸Pdots的Off-time间隔符合Power-law分布。通过优化标记,该工作还实现了高密度的亚细胞结构标记和超分辨成像结果。小尺寸光闪烁聚合物量子点有望大大提高超分辨成像的时空分辨率,减少光毒性,实现长时间超分辨成像(如图 16所示)[83]

      图  16  聚合物荧光探针分子58~59化学结构式,荧光闪烁特性和单色细胞微管标记图像[83]

      Figure 16.  Chemical structure and photoblinking property of fluorescent polymer probe molecules(58~59), single-color microtubule images labelled with polymer dots[83]

      为了能够实现高通量多通道实时的亚细胞结构的超分辨荧光成像,研究团队通过高通量筛选并调控制备方法,成功制备出具有闪烁特性的小尺寸Pdtos。PFO和PFTBT5 Pdots(分子61, 62)具有较窄荧光光谱(半高全宽分别为40 nm和70 nm)、较好的生物兼容性以及较高的光稳定性。此外,由于PFTBT5的聚合物骨架中引入了二噻吩基苯并噻二唑的受体基团,使其能够在488 nm激光的激发下发射红色荧光。与单色(PFBT和CN-PPV)SOFI相比,PFO与PFTBT5 Pdots具有不同的激发波长,且其荧光光谱无交叠,这就为实现基于Pdots的双色SOFI实验提供了可能。

      PFO与PFTBT5的单粒子荧光性质结果表明在相应的激发光激发下二者均具有明显的荧光闪烁特性。统计表明,PFO和PFTBT5 Pdots的Off-Time间隔符合Power-law分布,适用于基于荧光涨落的SOFI成像技术。通过优化蛋白标记,该团队实现了不同种类Pdots对不同亚细胞结构(微观结构,网格蛋白有被小窝,线粒体膜)的高密度标记并实现双色超分辨成像。实验结果表明,Pdots标记的网格蛋白有被小窝的超分辨成像结果与传统荧光成像结果分辨率相比具有1.89倍的提升,微管结构的双色SOFI结果表明,其分辨率具有1.93倍的提升(如图 17所示) [84]

      图  17  聚合物荧光探针分子61~62化学结构式,荧光闪烁特性和细胞微管多色标记图像[84]

      Figure 17.  Chemical structure and photoblinking property of fluorescent polymer probe molecules(61~62), multi-color microtubule images labelled with polymer dots[84]

    • 2000年,Gustafsson教授首次提出SIM[22-23]。SIM是基于激光的宽场显微镜,在入射激光光路中配置可移动的衍射光栅使入射光在物镜焦平面产生强度分布为正弦形式的衍射条纹。成像过程中,通过条纹形状的入射光与物体不同角度之间的混频形成摩尔条纹。将原本在成像过程中物镜对物体损失的高频信息(物体的细节信息)的损失通过形成摩尔条纹以低频信息(包含有原来物体的细节信息)的方式来记录。经过在频域的变换,以高分辨率的形式重建出物体细节成分。SIM成像需要拍摄物体焦平面不同角度的图像以便后期处理过程能够完整呈现出被拍摄物体的细节信息。通常,SIM比传统宽场显微镜能够提高一倍的分辨率。2005年,Gustafsson教授提出饱和结构光照明成像(SSIM),将结构光的条纹间隔压窄以得到更高的分辨率,如图 18所示。

      图  18  SIM/SSIM原理图, 宽场显微镜和SIM显微镜下GFP标记的COS-7细胞线粒体结构图

      Figure 18.  Principlephotos of SIM and SSIM. GFP-stained mitochondria in COS-7 cells imaged with conventional wide-field and structured illumination microscopy

      从SIM的工作原理可知,SIM成像对所拍摄物体的荧光探针无特殊的要求。因此本文不对SIM成像所需的探针进行总结。

    • 超分辨成像技术的出现打破了经典的阿贝光学衍射极限理论,使得传统光学显微镜可以以纳米尺度的空间分辨率对亚细胞精细结构、生物大分子空间构象以及动态过程成像。超分辨成像技术极大地推动了生命科学的进步,已然成为科学研究中不可缺少的重要的工具。这些技术的发展离不开各科研团队的不懈努力,从不同的角度实现了超分辨率成像。对于通过外加一圈环状激光来压缩调制点扩散函数的超分辨技术,最常用的是以Hell从理论提出并实现的受激发射损耗荧光显微镜(STED),通过不断地对系统的优化以及对荧光探针的不断开发,最终使得STED荧光显微镜在生物学研究实现了超高的分辨率。当然,通过调制PSF的技术并不限于STED,还包括基态损耗显微镜(GSD)等超分辨技术。基于单分子定位技术的超分辨荧光显微镜(PALM、STORM)在近些年同样取得了全面的发展并为生物学家提供了精细的亚细胞结构,在细胞动态过程的研究中发挥了重要的作用。此外,基于探针荧光涨落的超分辨光学涨落成像(SOFI)技术凭借其优异的时空分辨率、成像深度以及较低的光毒性,成为活细胞结构和生物功能超分辨成像家族的优秀成员。

      目前主流的超分辨率成像方式已经在生命科学的研究中扮演了举足轻重的角色。这些技术的实现都离不开对成像探针的不断发展及优化。虽然目前常用的超分辨率荧光成像已经取得一系列研究成果,使得科学家们能够以空前的分辨率去探究生物学过程。但是,目前主流的荧光成像探针仍然存在进一步提升的空间。比如,通常应用到PALM和STORM的荧光蛋白具有内源性,且具有较好的光转换、光激活性质,但是与其他的有机染料等荧光分子相比,其发射光子数目远远不及其他的荧光探针,给成像的对比度以及时间分辨率带来一定的限制。通常用到超分辨荧光显微镜中的罗丹明衍生物、香豆素衍生物和花青衍生物等有机染料荧光探针具有较高光子数和光子发射效率。然而,有机小分子荧光探针的光稳定性仍然有待进一步的提高。目前常用的有机荧光探针在长时间的成像过程中,仍然需要合适的除氧系统或者是合适的成像缓冲溶液的辅助。对于无机量子点(Qdots)作为生物荧光探针而言,其可调的发射光谱、较宽的吸收光谱、较高的量子效率等优异的光学性质在光学超分辨成像探针中也有着诸多的应用。非核-壳结构的Qdots表现出的随机荧光闪烁性质恰好符合新兴的超分辨光学涨落成像(SOFI)技术对荧光探针的要求。然而,即便是通过各种方式的修饰或改造,常用的Qdots中的重金属离子所引起的生物毒性仍然是个值得关注的问题。近期应用到SOFI的聚合物量子点(Pdots),具备了传统荧光探针各项优异的光学性质,通过调控Pdots的结构及材料尺寸,可以得到具有随机闪烁特性的Pdots荧光探针。对于Pdots荧光探针在超分辨成像中的应用而言,目前只适用于SOFI以及对成像探针要求不苛刻的SIM成像中,因此在空间分辨率提升的方面仍有一定的空间。对于打破传统的光学衍射极限,科学家们都展示出了极大的兴趣。除了本文中着重列举了发展的较早且技术较为成熟的几类超分辨成像技术,近两年的另一类超分辨成像技术正在受到人们的关注。科学家从生物样品本身出发,通过一定的方式让生物样品实现膨胀实现超分率成像。因此,随着超分辨技术的不断扩增,对生物荧光探针的需求仍然日益增长。设计开发光学性能优异、无生物毒性、普适性强的超分辨成像荧光探针仍是富有挑战的研究课题。

参考文献 (84)

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